Immunofluorescence

L’immunofluorescence est une technique d’immunomarquage, qui utilise des anticorps (ou immunoglobulines) ainsi que des fluorochromes.

Sommaire

Historique

Le phénomène de fluorescence fut découvert au milieu du 19° siècle par le scientifique anglais Sir George Gabriel Stokes. Il fut le premier à faire l'observation que la fluorine (un minéral), émettait de la fluorescence quand il était soumis à des rayons ultra-violet, et il lui donna le nom de "fluorescence".

Principes de l'immunofluorescence[1],[2],[3].

Il existe deux types de fluorescence. Tout d’abord, la fluorescence dite « naturelle », ou auto-fluorescence, émise spontanément par la cellule. On peut citer par exemple la chlorophylle des cellules végétales. Ensuite il y a la fluorescence conférée par un fluorochrome, substance chimique qui émet de la lumière si elle est excitée à une certaine longueur d’onde.

Immunofluorescence directe

En immunofluorescence, on peut réaliser deux types de marquages. Le premier est l’immunofluorescence directe. Lors de ce marquage, on utilise un anticorps dirigé contre la molécule recherchée, appelée antigène. Cet anticorps est couplé à un fluorochrome. Ensuite pour révéler la préparation, on peut utiliser un microscope à épifluorescence ou un microscope confocal.

Immunofluorescence indirecte

C'est le second marquage. Dans ce cas, on a deux anticorps. L’anticorps primaire est dirigé contre l’antigène recherché. Ensuite on utilise un deuxième anticorps, marqué par un fluorochrome, et possédant une haute affinité pour l’anticorps primaire (dirigé contre l’isotype de l’anticorps primaire, il s'agit alors d'une antiglobuline.)

Avantages et inconvénients

Comme avantages, il y a la possibilité de réaliser des marquages multiples sur un même échantillon de cellules, la rapidité et la facilité d'utilisation de cette méthode et aussi une bonne fiabilité de celle-ci. De plus en immunofluorescence indirecte, on a une augmentation de l’intensité lumineuse, car il y a plusieurs sites de fixation sur les anticorps primaires, ce qui permet d’avoir plusieurs anticorps secondaires fixés dessus.

Mais ils y a quelques inconvénients. Par exemple, la possibilité de réaction faussement positives ou faussement négatives, l'appréciation subjective du degré de fluorescence et le phénomène de photo-blanchiment. Pour pallier ces inconvénients, il existe plusieurs techniques. Tout d’abord, réaliser un témoin négatif pour l’immunofluorescence indirecte, c'est-à-dire mettre que les anticorps secondaires (marqués) en contact avec l’échantillon à analyser. Après une étape de lavage, si le témoin négatif est bon, il ne doit pas avoir de fluorescence émise, car les anticorps secondaires n’ont pas pu se fixer, et ils sont donc partis après l’étape de lavage. Ensuite, l’utilisation de caméra haute résolution et haute sensibilité atténue le photoblanchiment et permet une étude quantitative de l'acquisition.

Domaines d'utilisation[4]

On peut distinguer deux domaines:

Le diagnostic

  • En bactériologie, on utilise l’immunofluorescence pour une détection directe de bactéries dans les liquides biologiques. Mais aussi pour la recherche d’anticorps anti-microorganisme, par immunofluorescence indirecte.
  • En virologie, l’immunofluorescence directe est utilisée pour réaliser des cinétiques d’apparition d’antigène cellulaire ou viral. Et l’immunofluorescence indirecte est employée pour une recherche d’un virus d’infection.
  • En anatomie pathologique (réalisation d’une biopsie), l’immunofluorescence directe sert à déceler les dépôts d’immunoglobulines ou des protéines du complément dans les tissus. Ensuite en cancérologie, on peut quantifier l’expression d’oncogènes par cytofluorimétrie. Enfin, l’immunofluorescence peut servir à déterminer la qualité du sperme, afin de diagnostiquer une stérilité.

la recherche fondamentale

  • Observation de la division cellulaire
  • Analyse du cycle cellulaire, dont l'apoptose
  • Activation cellulaire
  • Hybridation moléculaire
  • Localisation intracellulaire, on peut utiliser la vidéo microscopie, mais aussi les protéines recombinantes.

Innovations

  • Il existe des programmes de quantification et de reconstruction 3D, couplé à un microscope confocal ou à épifluorescence. Avec aussi, un programme de déconvolution, qui améliore la netteté de l’image ou de la vidéo.
  • Phénotypage cellulaire en haut-débit, en plaque quatre-vingt seize puits par exemple.


L'immunofluorescence est utilisée sur les cellules en culture (on parlera alors d'immunocytochimie) ou sur des coupes de tissus (immunohistochimie).

Sources

  1. [1]
  2. Immunologie, 4° Edition, EM inter
  3. Immunologie générale connaissance et pratique, 8° édition revue et complétée ,MASSON
  4. [2]

Wikimedia Foundation. 2010.

Contenu soumis à la licence CC-BY-SA. Source : Article Immunofluorescence de Wikipédia en français (auteurs)

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