HPLC

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HPLC

Chromatographie en phase liquide à haute performance

La chromatographie en phase liquide √† haute performance ‚ÄĒ CLHP, mais on trouve plus fr√©quemment l'abr√©viation anglaise HPLC (high performance liquid chromatography) depuis les ann√©es 1990 ‚ÄĒ est une technique de s√©paration analytique en fonction de l'hydrophobicit√© et pr√©parative des mol√©cules d'un compos√© ou un m√©lange de compos√©s. Pour certains, HP signifie ¬ę haute pression ¬Ľ.

Cette forme de chromatographie est fréquemment utilisée en biochimie, ainsi qu'en chimie analytique.

Sommaire

Principe

L'√©chantillon √† analyser est pouss√© par un liquide (appel√©e phase mobile) dans une colonne remplie d'une phase stationnaire de fine granulom√©trie (les "grains" sont de tr√®s petite taille). Le d√©bit d'√©coulement de la phase mobile est √©lev√© ce qui entra√ģne une augmentation de la pression dans le syst√®me. Ce d√©bit √©lev√© diminue le temps n√©cessaire pour s√©parer les composants le long de la phase stationnaire. La fine granulom√©trie de la phase stationnaire permet une meilleure s√©paration des composants. En effet, pour un m√™me volume de phase stationnaire la surface d'√©change augmente si les "grains" qui la composent sont de diam√®tre plus petit. Les pics obtenus sont plus √©troits donc la r√©solution est am√©lior√©e (les pics sont bien s√©par√©s, on peut donc bien les diff√©rencier), le seuil de d√©tection est √©galement plus bas (des pics √©troits et hauts sont plus faciles √† isoler du bruit de fond que des pics larges et bas). La combinaison de ces attributs - rapidit√© et r√©solution √©lev√©es - conduit √† l'appellation ¬ę haute performance ¬Ľ.
Les solvants utilisés sont des combinaisons miscibles d'eau et de divers liquides organiques (alcools, acétonitrile, dichlorométhane, ...).
Souvent, la composition de la phase mobile est modifiée au cours de l'analyse, c'est le mode dit "gradient" ou "élution graduée" (en opposition au mode "isocratique", pour lequel la composition de la phase mobile reste la même tout au long de l'analyse). Par exemple, sur une colonne apolaire, en utilisant un mélange eau/méthanol comme phase mobile, les composants les plus hydrophobes sont élués avec une concentration élevée en méthanol alors que les composants plus hydrophiles sont élués préférentiellement avec une concentration faible en méthanol. Selon la nature de la phase stationnaire, on commencera par une concentration élevée en méthanol ou le contraire.


Appareillage et fonctionnement

La pompe

C'est la partie qui sert √† stocker l'√©luant et √† l'injecter sous pression dans la colonne. Elle est compos√©e de :

On utilise une pompe pour une élution isocratique ou plusieurs pour une élution par gradient.

L'injecteur

Des tubes en acier inoxydable, en Teflon, en PEEK ou en silice fondue permettent de relier la ou les pompes √† l'injecteur chromatographique. Il y a plusieurs types d'injecteurs :

  • Boucle d'injection : permet la r√©p√©tabilit√© du volume d'injection
  • Injecteur seringue
  • Extraction sur phase solide en ligne

La colonne

Elle d√©pend du type de chromatographie en phase liquide que l'on veut faire et donc de la nature et du nombre de compos√©s que l'on veut s√©parer. Il peut y avoir plusieurs colonnes parall√®les. Il y a donc plusieurs types de chromatographies en phase liquide :

La chromatographie d'adsorption

Article d√©taill√© : Chromatographie d'adsorption.

Dans cette chromatographie, la phase stationnaire consiste en une matière solide à grand pouvoir d'adsorption, tel que l'oxyde d'aluminium, les silicates de magnésium, les gels de silice. Les composants sont simplement plus ou moins retenus à la surface de la phase stationnaire par adsorption physique. C'est une technique qui prend en compte la polarité des composants.

La chromatographie de partage

Article d√©taill√© : Chromatographie de partage.

Dans cette chromatographie les analytes sont s√©par√©s en fonction de leur affinit√© avec les phases stationnaire et mobile. L'affinit√© d√©pend de la polarit√© des analytes et des phases. En mode normal la phase stationnaire est polaire, en mode inverse elle est apolaire. Il y a deux types de chromatographie de partage :

  • liquide - liquide : la phase stationnaire consiste en une tr√®s fine couche de liquide r√©partie par adsorption physique √† la surface du mat√©riau support le plus inerte possible. Les composants sont s√©par√©s comme dans une extraction liquide-liquide, sauf que la r√©partition des composants se fait lors du passage dans la phase liquide et non par agitation.
  • liquide - solide ou liquide - phase greff√©e : la phase stationnaire consiste en une esp√®ce organique li√©e par des liaisons chimiques √† la surface des particules du mat√©riau support.

La chromatographie par échange d'ions

Article d√©taill√© : Chromatographie √† √©change d'ions.

La phase solide est une résine insoluble munie de groupes fonctionnels capable de dissocier. Ce sont, habituellement, des groupes "acide sulfonique" (SO3H) pour les échangeurs de cations et "ammonium quaternaire" (N(R)3) pour les échangeurs d'anions.

La chromatographie d'exclusion stérique

Article d√©taill√© : Chromatographie d'exclusion st√©rique.

Les composants sont séparés selon leur dimension moléculaire. La phase stationnaire est composée d'un matériau poreux (petites particules de silice ou de polymères), les molécules dont le diamètre est supérieur à celui des pores ne peuvent pénétrer et ne sont pas retenues. La durée de séjour dans la colonne augmente lorsque la taille des analytes diminue.

La chromatographie chirale

Article d√©taill√© : Chromatographie chirale.

Cette technique de chromatographie consiste en la formation de liaisons non covalentes entre les énantiomères du substrat et l'absorbant chromatographique chiral donnant des complexes diastéréoisomères ayant des affinités de liaisons différentes. Elle sert donc en particulier à séparer des énantiomères.

Le détecteur

Il existe plusieurs types de d√©tecteurs :

  • D√©tecteur √† absorption UV ou visible
  • D√©tecteur √† indice de r√©fraction
  • D√©tecteur UV √† barrette de diodes (DAD)
  • D√©tecteur √† fluorescence
  • D√©tecteur de type spectrom√®tre de masse (MS)
  • D√©tecteur √©vaporatif √† diffusion de la lumi√®re (DEDL)

Les différentes phases stationnaires

Phase normale

Les colonnes en phase normale sont des colonnes dont la phase stationnaire est polaire et acide.

La phase normale la plus utilis√©e est √† base de gel de silice : √† sa surface se trouvent des groupes silanols (-OH) et des groupes siloxanes (-O-). Ces groupes permettent √† la silice de retenir les compos√©s √† analyser par des liaisons hydrog√®nes.

Cette phase sert ainsi principalement à séparer des composés polaires.

Phase inverse

La base d'une phase inverse est une phase normale sur laquelle des cha√ģnes alkyles (ou autres selon la polarit√© recherch√©e) ont √©t√© greff√©es au niveau des groupes silanols (end-capping). En g√©n√©ral, la phase stationnaire est majoritairement compos√©e de petites particules de silice sur lesquels on a greff√© des fonctions chimiques, le plus souvent de chaines alkyles √† 8 ou 18 atomes de carbones.
Les fonctions silanols (Si-OH) qui subsistent engendrent des interactions hydrophiles parasites, qui rendent les résultats non reproductibles surtout pour les molécules basiques. Pour éviter cela, la surface de la silice est généralement recouverte par une fonction méthyle et les fonctions silanols ne sont plus libres mais sous la forme (Si-O-CH3), c'est cette étape que l'on appelle "end-capping". Les fonctions chimiques utilisées pour le "end-capping" peuvent toutefois être de nature très diverses et les colonnes de dernières générations résistant à des pH extrêmes sont généralement "end-capped" avec des fonctions proposant une plus grande gène stérique, tel que le tert-butyle (Si-O-C(CH3)3).

Selon le taux de greffage, on obtient une plus ou moins grande résolution.

Cette phase stationnaire est dite "inverse" car de polaire et hydrophile (sans les "greffes"), la phase devient apolaire et hydrophobe.

Paramètres de chromatographie

La qualité et la durée d'une séparation peuvent changer avec la nature de la phase stationnaire et de la phase mobile utilisées. Mais pour un même type de phase stationnaire et une même phase mobile, la qualité et la durée d'une séparation peuvent aussi être modifiées par les caractéristiques géométriques et opératoires de ces deux phases.

Caractéristiques géométriques de la phase stationnaire

  • la longueur L et le diam√®tre interne dc de la colonne
  • le diam√®tre des particules de phase stationnaire dp

Caractéristiques opératoires de la phase mobile

  • la vitesse lin√©aire de l'√©coulement u
  • la perte de charge ou pression appliqu√©e őĒP entre l'entr√©e et la sortie de la colonne (la pression de sortie √©tant g√©n√©ralement atmosph√©rique). Elle est donn√©e par la loi de Darcy

\Delta P = \Phi \cdot \frac{\eta \cdot L \cdot u}{{d_p}^2}
o√Ļ ő∑ est la viscosit√© de la phase mobile et ő¶ est le facteur de r√©sistance √† l'√©coulement qui d√©pend de la forme des particules et de la qualit√© du remplissage de la phase stationnaire.
Pour des colonnes bien remplies de particules sph√©riques ou irr√©guli√®res, la formule empirique suivante, √©tablie avec les unit√©s usuelles, permet le calcul commode d'une estimation de őĒP en fonction du d√©bit F de la phase mobile avec une incertitude inf√©rieure √† 25%

\Delta P (MPa) = 400 \cdot \frac{F (ml/min) \cdot L (cm) \cdot \eta (cP)} {{d_p (\mu m)}^2 \cdot {d_c (mm)}^2}

Remarque : la loi de Darcy est √† l'hydraulique ce que la loi d'Ohm est √† l'√©lectricit√©. La pression hydraulique est analogue au potentiel √©lectrique, le d√©bit de liquide est analogue √† l'intensit√© du courant, la perm√©abilit√© hydraulique est analogue √† la conductivit√© √©lectrique, la pressurisation et la d√©pressurisation d'une colonne chromatographique sont respectivement analogues √† la charge et √† la d√©charge d'un condensateur √©lectrique.

Grandeurs caractéristiques en chromatographie

Le r√©sultat observable d'une analyse HPLC se pr√©sente sous la forme d'une courbe du signal d√©tect√© en fonction du temps : c'est le chromatogramme. Il comporte plusieurs pics de forme gaussienne, de caract√©ristiques diff√©rentes :

  • le temps de r√©tention ou tR, temps du maximum du pic. On appelle t0 ou temps de r√©tention nulle le temps correspondant √† un compos√© non retenu chromatographiquement.
  • la largeur du pic, mesur√©e √† mi-hauteur : ŌČ1/2, ou √† sa base, par l'intersection des tangentes du pic √† ses points d'inflexion avec la ligne de base : ŌČ.


De l√† peuvent √™tre calcul√©es plusieurs caract√©ristiques de la colonne pour la s√©paration des pics :

  • le facteur de r√©tention k' du pic, par la formule

k' = \frac{t_R - t_0}{t_0}

  • l' efficacit√© N ou nombre de plateaux th√©oriques, reli√©e √† la largeur du pic par la formule

N = 16 \cdot \frac{t_R^{2}}{w^{2}} = 5,54 \cdot \frac{t_R^{2}}{w_{1/2}^{2}}
Cette valeur mesure la finesse du pic. À partir de cette valeur peut être calculée la hauteur équivalente à un plateau théorique (HEPT) H, qui permet de comparer des colonnes de longueur différente
H = \frac{L}{N}

  • la s√©lectivit√© őĪ entre deux pics 1 et 2 (2 √©tant plus retenu que 1), d√©finie par le rapport de leurs deux facteurs de r√©tention

\alpha = \frac{k'_2}{k'_1}
Elle mesure la capacité de la colonne à séparer les maxima des pics. Plus elle est supérieure à 1, plus les temps de rétention sont éloignés.

  • la r√©solution RS entre les pics 1 et 2

R_S = 2 \cdot \frac{t_{R2} - t_{R1}} {w_{1} + w_{2}}
Cette valeur mesure la qualité de séparation et d'absence de recouvrement entre les 2 pics considérés.


La résolution ainsi définie est l'objectif de la séparation chromatographique. C'est une fonction des trois caractéristiques (efficacité, sélectivité et rétention), elles-mêmes définies ci-dessus, dont l'expression est
R_{S1,2} = \frac1 4\cdot\sqrt{N}\cdot\frac{\alpha-1} {\alpha}\cdot\frac{k'_2} {1+k'_2}

Cette expression montre notamment qu'une même résolution peut être obtenue dans des conditions chromatographiques ou bien très efficaces (optimisation cinétique) ou bien très sélectives (optimisation thermodynamique). Quoi qu'il en soit, la performance qui caractérise la technique HPLC est définie par le pouvoir de résolution par unité de temps, ce qui n'implique pas systématiquement l'utilisation de la pression la plus haute possible.

Voir aussi

  • Portail de la chimie Portail de la chimie
  • Portail de la biochimie Portail de la biochimie
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Contenu soumis à la licence CC-BY-SA. Source : Article HPLC de Wikipédia en français (auteurs)


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