Electrophorese en gel d'agarose

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Electrophorese en gel d'agarose

√Člectrophor√®se en gel d'agarose

Cuve remplie de tampon et transformateur utilisés pour l'électrophorèse en gel d'agarose

L'électrophorèse en gel d'agarose est une méthode utilisée en biochimie et en biologie moléculaire pour séparer l'ADN, l'ARN ou des protéines en fonction de leur taille.

La technique de l'√©lectrophor√®se en gel d'agarose est bas√©e sur la s√©paration des acides nucl√©iques charg√©s n√©gativement sous l'effet d'un champ √©lectrique. Cette s√©paration s'effectue √† travers la matrice du gel d'agarose : les mol√©cules de plus petites tailles se d√©placent plus rapidement et migreront plus loin que les mol√©cules de tailles sup√©rieures[1].

Sommaire

Applications

Les avantages de l'électrophorèse en gel d'agarose sont les suivants:

  • pr√©paration ais√©e, rapide, et peu co√Ľteuse des gels d'agarose
  • pas de d√©naturation des √©chantillons
  • l'agarose plus ferme et moins toxique que le gel de polyacrylamide
  • les √©chantillons peuvent √™tre r√©cup√©r√©s en vue d'analyses suppl√©mentaires

Facteurs affectants la migration

Le facteur le plus important est la longueur de la mol√©cule d'ADN : la s√©paration se fait en fonction de la taille de l'ADN. Toutefois la conformation de l'ADN est aussi un facteur important. Ainsi pour √©viter les probl√®mes li√©s √† cette conformation, n'est s√©par√© sur gel d'agarose uniquement que de l'ADN lin√©aire (fragment d'ADN issu d'une digestion, ADN amplifi√© par PCR ou encore de l'ADNc).

L'augmentation de la concentration d'agarose dans un gel réduit la vitesse de migration et permet la séparation de fragment d'ADN de plus petite taille. Plus le voltage est important, plus la vitesse de migration augmente. Toutefois le voltage est limité en intensité, effectivement un fort voltage induit une augmentation de température ce qui peut faire fondre le gel.

La conformation d'ADN plasmidique, non dig√©r√© par une enzyme de restriction, migre √† diff√©rentes vitesses (du plus lent au plus rapide) : ADN circulaire, ADN lin√©aire et ADN superenroul√©.

Gel d'agarose

On utilise généralement un gel 1% m/v (1 g d'agarose pour 100 ml de volume final) en électrophorèse. Plus on veut un gel discriminant, plus on augmentera le pourcentage d'agarose.

Agarose

L’agarose est un polymère à base d'agar purifié. Différentes puretés d'agarose sont disponibles auprès des fournisseurs. En général, de l'agarose de grande pureté à la solidification lente est utilisé lorsque l'ADN doit être extrait du gel après migration.

Tampons

Il existe un nombre très varié de tampons. Les plus souvent utilisés sont le Tris/Acétate/EDTA (TAE), le Tris/Borate/EDTA (TBE) et le sodium borate (SB).

Le TAE possède le plus faible pouvoir tampon mais produit une meilleure séparation pour les fragments d'ADN de grande taille.
Le SB est relativement nouveau et inefficace pour la séparation de fragments d'ADN d'une taille supérieure à 5000 paires de bases (5 kb). Cependant sa faible conductivité permet l'utilisation d'un plus fort voltage (jusqu'à 35V/cm), ceci réduisant considérablement le temps de migration.

Des fragments d'ADN avec seulement quelques paires de bases de différences sont séparés en utilisant un gel d'agarose à 3% et avec un tampon SB de trés faible conductivité (1 mM lithium borate).[2]

Préparation

Exemple pour un mini-gel de 50 ml destiné à séparer des fragments de 2 à 5 kb

  • Pr√©parer le moule et le peigne appropri√©s au nombre et au volume des √©chantillons √† s√©parer.
  • Pr√©parer suffisamment de tampon (TAE, TBE) pour remplir la cuve (par exemple 200 ml) et pr√©parer le gel (50 ml).
  • Dans une fiole Erlenmeyer, peser la quantit√© d'agarose d√©termin√©e d'apr√®s le tableau suivant et en fonction de la taille des fragments √† s√©parer:
Pouvoir de séparation d'ADN linéaire, double brin, selon la concentration d'agarose du gel[3]
Concentration d'agarose (% en M/V) Gamme de tailles idéales (en kb)
0.3 5 ‚Äď 60
0.6 1 ‚Äď 20
0.7 0.8 ‚Äď 10
0.9 0.5 ‚Äď 7
1.2 0.4 ‚Äď 6
1.5 0.2 ‚Äď 3
2.0 0.1 ‚Äď 2
  • Pour l'exemple, il faudra donc fondre 600 mg d'agarose dans 50 ml de tampon: concentration finale de 1.2%, id√©ale pour s√©parer des fragments de 0.6 √† 6 kb.
  • Dissoudre compl√®tement l'agarose dans le tampon, en pla√ßant l'Erlenmeyer soit au four √† micro-ondes, soit encore dans un bain marie d'eau bouillante, et en agitant de temps en temps. L'agarose est totalement dissout lorsque les grains, initialement visibles sous forme de petites lentilles, ont compl√®tement disparu.
  • Mettre sous agitation et laisser refroidir, ou placer dans un bain-marie √† environ 50¬įC (temp√©rature supportable au toucher). √Čventuellement, refroidir plus rapidement en laissant couler un filet d'eau froide le long de l'Erlenmeyer, en agitant constamment. Il est particuli√®rement important de refroidir l'agarose en dessous de 60¬įC lors de l'utilisation de moules en PMMA, qui risquent sinon de fondre.
  • Si d√©sir√©, du bromure d'√©thidium peut maintenant √™tre rajout√©, √† une concentration finale de 0.5 ¬Ķg/ml. Il est cependant d√©conseill√© d'ajouter √† la place du bromure d'√©thidium certains autres r√©v√©lateurs (par exemple du SYBR Gold, un fluorophore semblable au (SYBR Green I) directement dans gel, car ceux-ci peuvent affecter la mobilit√© des acides nucl√©iques lors de l'√©lectrophor√®se.
  • Couler l'agarose dans le moule avec le peigne et laisser refroidir. Un gel froid et fig√© pr√™t √† l'emploi se reconna√ģt par son apparence opalessante lorsqu'il est observ√© par la tranche, par rapport √† un gel encore liquide qui est parfaitement translucide. Emball√© dans du film plastique ou dans du tampon (TAE, TBE ou SB), le gel peut alors √™tre conserv√© √† 4¬įC au r√©frig√©rateur pendant plusieurs jours, avant qu'il ne perde trop d'eau par √©vaporation. La conservation de gels contenant du bromure d'√©thidium dans du tampon n'en contenant pas peut conduire √† la diffusion du r√©v√©lateur hors du gel. Ceci peut faire que la distribution du bromure d'√©thidium dans le gel soit inhomog√®ne, ce qui finalement peut affecter l'apparence des bandes (les acides nucl√©iques, de charge n√©gative, migreront plus vite l√† o√Ļ la concentration du r√©v√©lateur, de charge positive, sera plus faible).
  • Juste avant d'effectuer l'√©lectrophor√®se, placer le gel dans la cuve et s'assurer qu'il est recouvert de tampon. Retirer ensuite le peigne, charger les √©chantillons et les standards, et faire migrer en appliquant une tension ou un courant adapt√©s. La vitesse de migration des acides nucl√©iques d√©pendant du champ √©lectrique, on fixe g√©n√©ralement la tension entre 1 et 5 V par cm (distance entre les √©lectrodes) et on laisser varier le courant (parce que la conductivit√© du gel varie au cours du temps).

Révélation de l'ADN

Gel d'électrophorèse sous UV

La m√©thode r√©v√©lation la plus utilis√©e est la r√©v√©lation au bromure d'√©thidium ou BET. Le bromure d'√©thidium est un agent d'intercalation couramment utilis√© comme marqueur d'acide nucl√©ique dans les laboratoires de biologie mol√©culaire. Lorsqu'il est expos√© √† des rayonnements ultraviolets, il devient fluorescent avec une couleur rouge-orang√©e, 20 fois plus intense lorsqu'il est li√© √† l'ADN. Cet effet serait d√Ľ √† l'augmentation de l'hydrophobie de l'environnement, plut√īt qu'√† une rigidification du cycle benz√©nique, celui-ci n'√©tant pas situ√© entre les paires de bases.

Alternativement, le gel peut être incubé dans un bain contenant du SYBR Green I (pour les acides nucléiques double brin) ou du SYBR Green II (pour détecter aussi les acides nucléiques simple brin). Le SYBR Green présente l'avantage d'une moindre toxicité et d'une sensibilité plus élevée permettant de détecter des quantités plus faibles d'acides nucléiques.

Limites de résolution

L'électrophorèse en gel d'agarose permet théoriquement la séparation de fragments d'ADN d'une taille allant de 50 paires de bases à plusieurs millions. Cependant, elle est généralement utilisée pour la séparation de fragment d'une taille allant de 100 pb à 20 kb. La durée moyenne de migration est d'une heure.

Les petits fragments d'acides nucléiques sont mieux séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Les fragments de tailles importantes sont plus difficiles à séparer. En général, l'utilisation de gel d'agarose à forte concentration (3 à 4%) est alors nécessaire pour des fragments inférieurs à 150 pb, car elle permet une meilleure séparation et résolution des différentes bandes en fonction de leur différence de taille. Le principal désavantage est le temps de migration, qui peut aller jusqu'à plusieurs jours. Pour pallier ces problèmes, il est avantageux d'effectuer une électrophorèse en champ pulsé ou bien une électrophorèse en champ inversé.

Analyse du gel

Echelle de marqueur de taille moléculaire

Après la migration d'électrophorèse, le gel est éclairé sous ultraviolet afin d'observer les bandes d'ADN fluorescente.

Les bandes peuvent √™tre alors d√©coup√©es et s√©par√©es du gel, puis dissoutes afin de r√©cup√©rer l'ADN purifi√©. L'estimation de la taille des fragments est faite gr√Ęce √† la comparaison avec l'√©chelle de marqueur de taille mol√©culaire (DNA-ladder) utilis√©e simultan√©ment dans un autre puits lors de la migration.

Le gel est généralement pris en photo avec un appareil photo numérique. Bien que la couleur de l'ADN fluorescent soit rouge-orangée, les photographies sont publiées en noir et blanc (voir schéma ci-dessous).

Les gels d'électrophorèse utilisés en vue de publications sont le plus souvent analysés en utilisant des logiciels informatiques, comme par exemple ImageJ.

1 2 3
Un gel d'agarose avant éclairage sous ultraviolets
Le gel est exposé à des rayonnements ultraviolets, le BET colore l'ADN en une couleur rouge-orangée.
Photographie du gel. Puits 1. Echelle de marqueur de taille moléculaire (1kbplus), Puits 2. vide, Puits 3. Un produit de PCR d'une taille légèrement supérieure à 500 paires de bases, Puits 4. Fragment d'environ 4.5kb d'un Plasmide digéré par une enzyme de restriction

Références

  1. ‚ÜĎ Sambrook J, Russel DW (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY.
  2. ‚ÜĎ Brody JR, Calhoun ES, Gallmeier E, Creavalle TD, Kern SE (2004). Ultra-fast high-resolution agarose electrophoresis of DNA and RNA using low-molarity conductive media. Biotechniques. 37:598-602. [1]
  3. ‚ÜĎ Sambrook J, Russel DW (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY.
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